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華雅干細(xì)胞為你解答ELISA樣本值低于空白值的問題

更新時(shí)間:2015-05-27 點(diǎn)擊次數(shù):1856
在ELISA實(shí)驗(yàn)中,樣本值低于空白值是一個(gè)經(jīng)常性的問題。當(dāng)樣本值較低接近試劑盒的靈敏度就容易發(fā)生樣本值低于空白值的現(xiàn)象,特別是在血清和血漿樣本的檢測。究其原因,主要在于兩個(gè)方面,一方面是誤差,另一方面是基質(zhì)效應(yīng)。下文逐個(gè)分析不同影響因素的原理、和解決方案。

一、基質(zhì)效應(yīng)

分析中,基質(zhì)指的是樣本中被分析物之外的組分,基質(zhì)常常對分析物的分析過程有顯著的干擾,并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,這些影響和干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)。ELISA試劑盒在開發(fā)過程中,標(biāo)準(zhǔn)品不能采用人或動物血清、血漿作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的稀釋液,只能采用其模擬物。模擬物與被測樣本在蛋白豐度、復(fù)雜性、pH等因素都會存在差異。當(dāng)樣本的基質(zhì)與其模擬物相比,降低抗原抗體的結(jié)合,便產(chǎn)生了樣本值低于空白值的現(xiàn)象。造成樣本值無法計(jì)算出數(shù)值,或者數(shù)值為負(fù)。

目前zui常用的去除基質(zhì)效應(yīng)的方法是,通過已知分析物濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品,同時(shí)盡可能保持樣本中的基質(zhì)不變,建立一個(gè)校正曲線。

二、誤差

誤差分為三類:系統(tǒng)誤差、隨機(jī)誤差和過失誤差。這三類誤差中,系統(tǒng)誤差對樣本值和空白值之間的差異無影響。ELISA樣本值低于空白值在誤差方面主要來源于隨機(jī)誤差和過失誤差。


1、 隨機(jī)誤差
無法控制的變因,使測量值產(chǎn)生隨機(jī)分布的誤差,服從統(tǒng)計(jì)學(xué)上的正態(tài)分布。從統(tǒng)計(jì)學(xué)上來看,測量值有99%的置信限在±3SD之間,如果CV值是20%,隨機(jī)誤差的邊界就是±60%,也就是說在CV值20%的狀況下,樣本值低于空白值60%之內(nèi),有可能是隨機(jī)誤差的影響,特別是空白值只有一個(gè)值時(shí)。
隨機(jī)誤差不可消除,只能通過多次測量獲得的均值盡量逼近真值。降低隨機(jī)誤差的解決方案1是增加空白值的重復(fù)數(shù)量,一般認(rèn)為空白值重復(fù)10次,測量均值接近真值。
方案2是提高實(shí)驗(yàn)技能,也能夠有效降低隨機(jī)誤差的影響。如果CV值在5%,樣本值趨近于零時(shí),在統(tǒng)計(jì)上樣本值將不會低于空白值15%。
2、 過失誤差
過失誤差主要是由于測量者的疏忽,犯了不應(yīng)有的錯(cuò)誤造成的。過失誤差是可以避免的。針對于ELISA樣本值低于空白值的問題,過失誤差產(chǎn)生的原因多數(shù)來源于空白孔HRP的重復(fù)加樣或污染或洗滌不干凈,造成空白值偏高,相對比來說,樣本值低于空白值。解決方案就是重復(fù)實(shí)驗(yàn),規(guī)范操作。

當(dāng)單個(gè)樣本或少量樣本值低于空白值時(shí),可能是誤差原因,這時(shí)應(yīng)增加重復(fù),提高操作技能。當(dāng)大量樣本都低于空白值時(shí),應(yīng)考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響,建立校正曲線予以修正。

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