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高起始量帶分子標(biāo)簽的DNA-Seq分析

更新時(shí)間:2020-11-10 點(diǎn)擊次數(shù):1810
高起始量帶分子標(biāo)簽的DNA-Seq分析
ThruPLEX® Tag-Seq HV
· 更可靠的DNA-Seq分析:文庫中整合了離散且均衡的分子標(biāo)簽(UMIs),提供更可靠的數(shù)據(jù)表現(xiàn)! 
· 兼容更高起始量的多種樣本:5至200 ng FFPE DNA、cfDNA起始,30 μl建庫體積,無需濃縮樣本!
· 刪繁就簡(jiǎn):單管三步操作流程,2 h內(nèi)完成illumina文庫構(gòu)建!
· 一致高效:無畏起始量差異,高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性、更均一的文庫覆蓋度,高GC含量區(qū)域偏差更??!
· 更適合于稀有突變分析,減少擴(kuò)增誤差及測(cè)序錯(cuò)誤!
 
■ 產(chǎn)品說明
目前,將NGS用于正確檢測(cè)低頻突變的關(guān)注度逐漸上升。各領(lǐng)域科研人員正在突破稀有突變檢測(cè)靈敏度與特異性的瓶頸,而這些問題主要是由樣品準(zhǔn)備、擴(kuò)增偏差及測(cè)序錯(cuò)誤所引起的。而向illumina文庫添加*的分子標(biāo)簽(Unique Molecular Identifiers, UMIs)與*的雙端index(Unique Dual Indexes, UDIs),能有效改善稀有突變檢測(cè)的準(zhǔn)確性。出于文庫制備與測(cè)序質(zhì)量直接相關(guān)的考慮,我們特別優(yōu)化推出了接頭上帶UMIs及整合UDIs的全新產(chǎn)品——ThruPLEX Tag-Seq HV試劑盒。該產(chǎn)品保留了單管流程、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn),支持5至200 ng input DNA起始用于稀有變異分析!
 
正確的樣本數(shù)據(jù)回溯、更小的手動(dòng)操作誤差,科研人員再不用擔(dān)心珍貴樣本損失了!
 
■ 來自UMIs的“助攻”
ThruPLEX Tag-Seq HV在莖環(huán)形接頭上引入了離散的UMIs,文庫中每個(gè)DNA分子有144種可能的標(biāo)簽組合,漢明間距超過6,具有高度的差異性。我們特別設(shè)計(jì)了UMI序列,以使序列顏色分布達(dá)到平衡,在illumina平臺(tái)上能獲得更好的測(cè)序數(shù)據(jù)。我們也謹(jǐn)慎調(diào)整了各UMI接頭的濃度,以使144種序列組合在各種DNA起始量都能均勻展現(xiàn),減少偏差。
由7位堿基所組成的UMIs位于reads的開始位置,能夠”Tag”到DNA模板上,用于識(shí)別一致序列,減少擴(kuò)增或者測(cè)序錯(cuò)誤帶來的假陽性突變。
這種特別優(yōu)化的UMIs設(shè)計(jì),確保了更簡(jiǎn)便的樣本demultiplexing過程,分析更容易!
 
■ “抓住”游離DNA,“揪出”稀有突變
游離DNA(cfDNA)是由細(xì)胞凋亡后所釋放,游離于體液中的DNA小片段。對(duì)cfDNA的測(cè)序分析具有較大難度,特別是涉及腫瘤學(xué)研究中的稀有突變分析時(shí)。
Takara科學(xué)家采用ThruPLEX Tag-Seq HV對(duì)10 ng起始的Quan-Plex Patient-Like ctDNA標(biāo)準(zhǔn)品(AccuRef)構(gòu)建文庫,該ctDNA(循環(huán)腫瘤DNA)標(biāo)準(zhǔn)品帶有一系列特征化的不同頻率(0%,1%,5%)突變位點(diǎn)。文庫構(gòu)建完成后,腫瘤相關(guān)的基因采用IDT xGEN Pan Cancer Panel進(jìn)行捕獲富集。結(jié)果顯示目標(biāo)區(qū)域的捕獲高效可靠,10 ng起始的DNA樣本約有79%的reads來自或者接近目標(biāo)區(qū)域。
 
上表數(shù)據(jù)顯示,由坐標(biāo)法或UMIs去除重復(fù)reads后的目標(biāo)區(qū)域平均覆蓋度是相似的,與Picard MarkedDuplicates所報(bào)道的PCR duplication結(jié)果一致。
隨后,Takara科學(xué)家用UMIs鑒定了ctDNA標(biāo)準(zhǔn)品中特定位點(diǎn)的實(shí)際突變頻率,結(jié)果顯示,檢測(cè)到的突變頻率分別與預(yù)期1%、5%的等位突變頻率接近,而陰性對(duì)照組沒有在位點(diǎn)處檢測(cè)到任何突變。
 
如果采用未去重的文件或僅用坐標(biāo)法去重的文件,會(huì)檢測(cè)出大量的超過0.5%等位基因頻率的不一致突變。而UMIs引入、校正后,相應(yīng)突變體的數(shù)量變少了,結(jié)果的正確性進(jìn)一步提升,顯示出UMIs在降低擴(kuò)增及測(cè)序錯(cuò)誤上的重要作用。
 
更具代表性的是,使用未去重或者僅用坐標(biāo)法去重的文件分析,在預(yù)期的EGFR L858R突變附近觀察到大量的低頻及隨機(jī)等位基因頻率突變。而用UMI校正、過濾后的一致性序列reads,清除了假陽性突變,得到了預(yù)期的突變分析結(jié)果!
 

訂購信息:

品牌              Code No.                  產(chǎn)品名稱                    包裝量  

Clontech     R400742     ThruPLEX® Tag-Seq HV     24 Rxns

Clontech     R400743     ThruPLEX® Tag-Seq HV     96 Rxns

Clontech     R400735     ThruPLEX® Tag-Seq HV Core Components     96Rxns

Clontech     R400734     ThruPLEX® Tag-Seq HV Core Components     24Rxns 

Clontech     R400739     ThruPLEX® HV UDI 1-24     24 Rxns

Clontech     R400738     ThruPLEX® HV UDI Set A     96 Rxns

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